猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“反相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
_______________________________________________________________________________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
【第 12409 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序
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【参考答案】
(1)逆转录
(2)①碱基互补配对 ②正相关
(3)①Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降 ②越小 ③阳性 (4)abc
猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“反相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
_______________________________________________________________________________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
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