【简答题】COR基因是植物的冷调节基因，其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害，具有提高抗寒性的作用。转录因子CBF(由CBF基因控制合成)能够特异性结合下游的靶基因启动子区，激活COR基因的表达。将不同植物的COR基因和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，转入植物体内能大幅提高植物的抗寒性。在构建基因表达载体时，需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不同的限制酶。当遇到平末端和黏性末端无法连接时，可利用Klenow酶特有的与DNA聚合酶作用相同的特性，将黏性末端补平后再与平末端连接。
(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段，根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B，在PCR过程中，经过四次循环消耗引物A和引物B共__________个，引物的作用是________________________________________。
(2)现有若干种限制酶，它们的识别序列和切割位点如图所示。为将COR基因表达载体和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，应选用Hed Ⅰ切割COR基因表达载体、用__________切割CBF基因的某一侧后再连接。为实现CBF基因与COR基因表达载体的另一侧连接，共需用到__________种酶。
 
(3)在转入超量表达载体的转基因植物中，转录因子CBF特异性识别下游的靶基因启动子区后，与______酶结合形成复合体，从而激活COR基因的表达。检测COR基因及其表达过程，可以采用的方法有____________________________________________(至少写出两种)。
(4)科学家在培育的转基因植物中，筛选到一棵AtNUP160植株(atnup160基因的突变体)，AtNUP160基因表达产物能通过干扰核孔复合体的形成，影响RNA的出核转运，进而影响植物的抗寒性。研究发现，AtNUP160植株中CBF基因表达水平降低，影响了COR基因的表达，导致抗寒性减弱。由此推断AtNUP160植株抗寒性减弱的机理是_____________________。

【简答题】钙依赖蛋白激酶(CDPK)在植物的信号传导和提高植物抗性方面发挥着重要作用。科学家通过将CDPK基因导入拟南芥(双子叶植物)中，来获得具有抗性的新品种。如图为某种质粒表达载体和含CDPK基因的DNA片段示意图，图中标记了限制酶的切割位点。据此回答下列问题：
 
(1)通过基因工程，将CDPK基因导入拟南芥中，获得具有抗性的新品种的育种原理是______________。为了使CDPK基因插入质粒中，应选取______________(两种限制性内切核酸酶)分别切割质粒和含目的基因的DNA片段。
(2)利用PCR可获得大量的CDPK基因，PCR扩增的第一步：用微量移液器在微量离心管中加入缓冲液、4种脱氧核苷酸的等量混合液、水、还需要加入_______________。PCR的产物一般通过琼脂凝胶电泳来鉴定，在凝胶中的DNA分子的迁移速率与____________有关。
(3)将CDPK基因导入拟南芥细胞通常采用的方法是_____________________。
(4)检测CDPK基因是否成功表达的方法是________________，若有杂交带出现，表明已产生了CDPK。

【简答题】抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。
(1)构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过限制酶和_________酶与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列_____(填“能”或“不能”)出现在目的基因内部，可通过_____技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。
(2)为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆技术(图2)，其中In­Fusion酶可以将任何具有相同15 bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。
①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In­Fusion反应。
如果引物2上额外添加的片段对应GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段_____。完成重组反应后，将重组表达载体加入经过_____处理的农杆菌中。
②为筛选成功转入重组DNA分子的菌落，可以选取引物_____扩增目的基因并电泳检测。请在图4中画出阳性菌落的电泳结果。
(3)农杆菌转化愈伤组织时，用含_____的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织(假阳性)也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，则排除假阳性的原理是：报告基因GUS在_____细胞中表达，而在农杆菌中不表达，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，假阳性的农杆菌_____(填“出现”或“不出现”)蓝色。

【简答题】铝在土壤中常以铝酸盐的形式存在，可造成土壤酸化而影响植物生长。铝能抑制植物根尖细胞的分裂，抑制根生长，破坏根组织。部分植物能通过根部细胞膜上的苹果酸通道蛋白（ALMT）将苹果酸转运到细胞外来缓解铝毒。可将 ALMT 基因导入植物细胞，来培育转基因耐铝植物，请回答下列问题：
（1）可以从基因文库中获得 ALMT 基因，在合成 cDNA 的过程中，反应体系内加入的物质除 mRNA 和 ATP 外，还包括____________、________________________。
（2）可将 ALMT 基因插入农杆菌 Ti 质粒的____________片段中，以便目的基因进入植物细胞。利用该方法导入的目的基因的遗传一般遵循孟德尔遗传定律，原因是________________________。
（3）启动子是____________特异性识别并结合的位点，能调控目的基因的表达。ALMT基因的启动子有两种类型，其中 α 启动子能使 ALMT 基因在酸性土壤的诱导下表达，β 启动子能使 ALMT 基因高效表达而无需酸性诱导。则在获得转 ALMT 基因耐铝植物时应使用________启动子，不使用另外一种启动子的原因是________________。

【简答题】转基因抗病香蕉的培育过程如图甲所示，图乙表示PstⅠ、SmaⅠ、EeoRⅠ和ApaⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。请据图回答下列问题：
（1）质粒的化学本质是_____________________ 。 
（2）利用基因工程培育转基因抗病香蕉的核心步骤是形成重组质粒，即_____________________；将目的基因导入受体细胞的方法是______________________________
  （3）将抗病基因从含抗病基因的DNA中切割下来，使用的限制酶是____________，图中一令质粒被限制酶PstⅠ、SmaⅠ、EeoRⅠ同时切割后得到的DNA片段和黏性末端分别为____________个。请写出单独用ApaⅠ切割质粒后的片段：______________________________。
  （4）转基因抗病香蕉的培育是否发生了染色体（数目）的变异? ____________。卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，根据这一原理可以利用含卡那霉素的培养基筛选已导入重组质粒的香蕉细胞。由此推断，重组质粒中应含有_____________________基因作为标记基因。