【简答题】COR基因是植物的冷调节基因，其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害，具有提高抗寒性的作用。转录因子CBF(由CBF基因控制合成)能够特异性结合下游的靶基因启动子区，激活COR基因的表达。将不同植物的COR基因和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，转入植物体内能大幅提高植物的抗寒性。在构建基因表达载体时，需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不同的限制酶。当遇到平末端和黏性末端无法连接时，可利用Klenow酶特有的与DNA聚合酶作用相同的特性，将黏性末端补平后再与平末端连接。
(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段，根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B，在PCR过程中，经过四次循环消耗引物A和引物B共________个，引物的作用是________________________________。
(2)现有若干种限制酶，它们的识别序列和切割位点如图所示。为将COR基因表达载体和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，应选用Hed Ⅰ切割COR基因表达载体、用________切割CBF基因的某一侧后再连接。为实现CBF基因与COR基因表达载体的另一侧连接，共需用到________种酶。
 
(3)在转入超量表达载体的转基因植物中，转录因子CBF特异性识别下游的靶基因启动子区后，与______酶结合形成复合体，从而激活COR基因的表达。检测COR基因及其表达过程，可以采用的方法有____________________________________(至少写出两种)。
(4)科学家在培育的转基因植物中，筛选到一棵AtNUP160植株(atnup160基因的突变体)，AtNUP160基因表达产物能通过干扰核孔复合体的形成，影响RNA的出核转运，进而影响植物的抗寒性。研究发现，AtNUP160植株中CBF基因表达水平降低，影响了COR基因的表达，导致抗寒性减弱。由此推断AtNUP160植株抗寒性减弱的机理是__________________。

【答案】：(1)30　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　(2)Mun Ⅰ　4　(3)RNA聚合　PCR、抗原－抗体杂交、在个体水平检测植株的抗寒性
(4)AtNUP160植株中AtNUP160基因的表达产物影响核孔复合体的形成，使得COR基因转录形成的mRNA无法转运出核，AtNUP160植株中转录因子CBF合成减少，导致COR基因转录减少，最终使COR基因转录出的mRNA在细胞质中处于较低水平，产生的亲水性多肽减少，植物抗寒性减弱

【解析】：(1)在PCR过程中，经过四次循环，共产生24＝16个DNA分子，DNA复制是半保留复制，复制的模板是DNA两条链，这两条链均不含有引物A或引物B，新合成子链均含有引物A或者引物B，因此经过四次循环消耗引物A和引物B共16×2－2＝30(个)。引物的作用是作为核苷酸聚合的起始点，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(2)根据图中所示限制酶切割位点和识别序列，实验室中构建抗寒基因超量表达载体时，目的基因CBF的两端有两种限制酶Mun Ⅰ和Xba Ⅰ，COR基因表达载体中有两个限制酶切点，其中Mun Ⅰ和Hed Ⅰ限制酶切割后能形成相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下可实现连接，而Xba Ⅰ切割CBF基因后形成的是黏性末端无法与Hed Ⅰ限制酶切割后形成的黏性末端相连接。为实现CBF基因与COR基因表达载体的另一侧连接，因此，需要在Xba Ⅰ切割 CBF基因后，利用Klenow酶特有的5′→3′DNA聚合酶活性，将黏性末端补平后再与Sam Ⅰ酶切割后平末端连接，所以，为实现CBF基因与COR基因表达载体的另一侧连接，应选用的限制酶是Xba Ⅰ、Sam Ⅰ、Klenow酶、DNA连接酶，共4种酶。
(3)基因的表达，需要RNA聚合酶与DNA上的启动部位相结合，启动转录过程。检测目的基因及其表达过程可以用PCR、核酸分子杂交、抗原—抗体杂交、在个体水平检测植株的抗寒性等。
(4)atnup160突变体中 AtNUP160基因表达产物减少，影响核孔复合体的形成，导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出细胞核，转录因子CBF减少，使得COR基因的表达水平明显降低，产生保护细胞免受冻害的亲水性多肽减少，植物抗寒性减弱。