【简答题】猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经_____酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。
 
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过__________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈_______(填“正相关”或“反相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
 
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
____________________________________________________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就_________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为_________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有_________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 
c．病毒发生变异

【单选题】荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是
 
A．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
B．耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键
C．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关
D．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高

【单选题】为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白HMA3基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的𝐻𝑀𝐴3基因，同时避免内源𝐻𝑀𝐴3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是
 
A.①+③             B.①+②         C.③+②          D.③+④

【单选题】减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR技术进行改良，发明了巢式PCR，原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物（外引物）对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或巢式引物）结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段（即目的基因），最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如图所示。下列叙述错误的是

A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段

B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物
C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低
D．普通PCR与巢式PCR相比，特异性更强，错误率更高

【多选题】热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除𝑇𝑎𝑞DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有
A. 𝑇𝑎𝑞酶最适催化温度范围为50∼60℃ 
B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了𝑇𝑎𝑞酶的特异性