【简答题】猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经____酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。
 
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈______(填“正相关”或“反相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
 
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
___________________________________________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 
c．病毒发生变异

【答案】：

(1)逆转录　

(2)①碱基互补配对　②正相关　

(3)①Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降　②越小　③阳性　(4)abc

【解析】：(1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过碱基互补配对形成氢键而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。根据题干信息“荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步”可知，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关关系。(3)①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是酶的活性缓慢下降导致的。②样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越少，Ct值就越小。③Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2中荧光阈值大概是36，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测阈值；样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性。