【简答题】

CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。

(1)研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA   键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过   次DNA复制可以完成修复。

(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是   。

(3)为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。

①PCR的一般过程为   ，在变性之前通常有预变性，其目的是   。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及   来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有   （至少答两点）。

②写出His的基因编码链的碱基序列5′   3′。

③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物   （填“A”或“B”）的5′端增加限制酶   的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′   3′。

【多选题】

荧光 PCR 法根据化学发光原理可以分为染料法和探针法。染料法中特殊染料本身不发光,但是当PCR 扩增的时候,染料能够与DNA双链结合从而发光,如图1所示。探针法中除了引物外另外设置了一个探针,在探针的两端分别带上发光基团和淬灭基团,此时发光基团并不发光,但是当DNA通过引物合成的时候,探针被酶切降解释放出发光基团和淬灭基团,两种基团分开后产生荧光,如图2所示。下列说法正确的是

A.两种方法均可用于目标 DNA 的定量分析
B.与染料法相比,探针法的特异性更强
C.通过适当延长引物长度和降低复性温度可提高荧光PCR的特异性
D.用荧光 PCR 法检测人体是否感染新冠病毒前需要先进行逆转录

【单选题】临床上可采用PCR和DNA反向点杂交相结合的检测技术对HPV基因进行分型,过程如下:设计出针对已知有致癌风险的23种HPV基因的特异性引物并标记上会发生显色反应的生物素,通过 PCR对待测样本 DNA进行扩增,再将扩增产物直接与固定在膜上的分型基因探针(包括17种高危型和6种低危型)进行杂交。经显色处理后,与固定化探针结合的HPV基因就会在相应位置产生显色反应,从而判断待测样本是否被含有这些HPV基因的病毒感染。有关说法错误的是
A.生物素应标记在引物的5'端
B.该检测技术需要对扩增的DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳
C.该检测技术具有高度的特异性,能够准确地区分不同类型的HPV病毒
D.反向点杂交是通过分型基因探针与扩增的目的片段碱基互补配对结合在起的

【单选题】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是
 
A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子

【单选题】重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是
 
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2