【简答题】

CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。

(1)研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA   键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过   次DNA复制可以完成修复。

(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是   。

(3)为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。

①PCR的一般过程为   ，在变性之前通常有预变性，其目的是   。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及   来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有   （至少答两点）。

②写出His的基因编码链的碱基序列5′   3′。

③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物   （填“A”或“B”）的5′端增加限制酶   的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′   3′。

 

 

【答案】：(1)     磷酸二酯     2/两/二
(2)当其他DNA序列也含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶
(3)     变性→复性→延伸     增加模板DNA彻底变性的概率     宽度     引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好     CATCATCATCATCATCATTAG     B     XhoⅠ     CTCGAGCTAATG