【第 12536 题】 【题型】：简答题 【章节】：
第2节 基因工程的基本操作程序
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【参考答案】(1) PCR BamH I和EcoR I
(2)潮霉素 T-DNA区段含有潮霉素抗性基因，可作为标记基因进行筛选 再分化
(3)幼苗长势好、作物产量高
(4)保免疫共沉淀前的样品中有靶蛋白A和待测蛋白B 3 抗PIP2
(5)高碱环境中AT1与PIP2相互作用抑制其磷酸化，从而抑制H2O2外排，导致植物细胞死亡;敲除AT1基因后，PIP2磷酸化上
升，促进H2O2外排，作物存活率提高
土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，培育耐盐碱农作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。
(1)为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建过表达植株（AT1-OE）。以高粱cDNA为模板，利用_____方法获取目的基因。如图1，选取最佳限制酶_____处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。
(2)将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，为筛选出T-DNA成功转入的愈伤组织，培养基中需加入_____，原因是_____。获得所需愈伤组织后，经_____发育成完整植株。同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。
(3)检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株_____，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。
(4)高碱条件下，植物细胞内H2O2含量升高，推测AT1可能与运输H2O2的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对实验组和对照组总蛋白进行免疫共沉淀，实验结果如图3。
①检测总蛋白的目的是_____。
②通过条带_____可以判断，AT1与PIP2有相互作用。若想进一步验证该相互作用，可用_____抗体与新磁珠偶联再次进行实验。
(5)细胞内过量的H2O2积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H2O2外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因_____。
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