【简答题】镰状细胞贫血是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病，是由位于人类6号染色体上的血红蛋白基因发生隐性突变导致的，纯合子患者多数在幼年时期因红细胞严重溶血而亡。某夫妻双方都为该致病基因的携带者，为了生下健康孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为这对夫妇及腹中孩子核酸分子杂交诊断的结果示意图。
请回答下列问题：

（1）由图中可知，正常基因B有三个酶切位点，由于发生了_______________导致突变基因b 上只有两个酶切位点。凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱。与图中正常基因模板链杂交的碱基对应序列为____________。
（2）根据凝胶电泳带谱分析，腹中胎儿的基因型为________。
（3）若通过基因治疗将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞将有望彻底治愈镰状细胞贫血。某科研团队设想运用重叠延伸PCR 技术来实现对致病基因的定点诱变，原理如右图所示：

①PCR过程中需要的物质有DNA 模板、引物、________________________
__________________________（至少写出两个）。
②该过程共用到4种引物，引物B的突起处的碱基应设计为_______（假设引物为单链DNA ，且上方这条链为模板链）。
③在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA 的过程中，两个反应系统中均进行一次复制，共产生_______种DNA 分子。请分析该阶段两个反应系统必须分开进行的原因是__________________。
④第二阶段PCR4 反应系统选择的引物为________________。

【简答题】动物器官移植到人体内（异种移植）或是解决全球器官紧缺的办法之一。研究团队对猪肾内皮细胞进行基因编辑、改造后，得到了3种工程细胞和可提供异种移植肾源的供体猪。具体流程及部分测量数据如图示。
 
(1)研究证实供体猪的3个聚糖抗原基因（3KO）会引致人类、猴等受体的组织不相容。若以未经改造的猪肾作为异体肾源进行器官移植，受体动物的________________ 细胞和抗体都有可能对供体器官产生特异性攻击效应，导致出现________________现象。利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除肾内皮细胞的3KO,该技术需人工设计一种“向导”RNA，其部分序列与3KO遵循_______原则结合，并引导Cas9蛋白断裂DNA双链，从而敲除3KO。
(2)研究表明7个人类基因（7TG）可增加不同物种之间的兼容性。获取7TG的方法有________________（答出一种即可）。
(3)为验证敲除3KO、插入7TG对异体细胞的保护作用，研究者将三组细胞与受体猴血清共孵育，置于CO₂培养箱中培养，CO₂的主要作用是________。测量裂解细胞数如图示。据此得出结论:          
 
(4)供体猪器官常携带多种病毒,其中部分病毒潜在人畜传播风险。例如已有实验证明PERV（猪内源性逆转录病毒）可以整合到体外培养的人类细胞基因组中。试分析若给人进行异种移植，PERV的基因可能通过供体猪器官整合到人类基因组的途径________________________ 。因此，为确保安全，对已构建好的3KO.7TG.细胞需要进行灭活PERV处理，且在临床试行前须在动物模型中测试。
(5)从3KO.7TG.RI.细胞通过④过程构建供体猪所利用的现代生物学技术有__________（至少答出一种）

【简答题】驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。

回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为_____，理由是________。

(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_______________（答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。

【简答题】斑点叶突变体是水稻在正常生长条件下在叶片或叶鞘上自发形成斑点的一类突变体，研究斑点叶突变体对揭示水稻的抗病反应机理具有重要意义。对野生型水稻进行诱变处理，获得一个水稻斑点叶突变体S。
【实验一】将突变体S与野生型水稻杂交，F1植株均为野生表型。F₁自交产生的F₂植株中，野生表型与斑点叶表型的比例接近3：1。
【实验二】检测发现，突变体S出现斑点叶表型是水稻中E基因突变所致（记为ES）。再对野生型与突变体S进行PCR扩增测序，测得相关基因和转录剪切后的mRNA的部分序列如图所示。

【实验三】进一步检测野生型和突变体S中E基因的相对表达量，发现突变体S中的表达量相较野生型显著下降。
回答下列问题：
(1)实验一F₂植株出现野生表型与斑点叶表型比例为3：1的原因是_________。
(2)实验二中，与野生型E基因序列相比，突变体S的ES基因中碱基对发生的变化为_____________。
(3)转录过程中通过_______酶的作用合成mRNA。真核生物中转录合成的mRNA在特定位点被识别后，部分序列在此会被剪切掉，其余序列加工形成成熟的mRNA。据此推测，突变体S成熟mRNA序列中只多出“AUAG”4个碱基的原因是_____________________。
(4)E基因表达水平的变化可通过分析水稻叶肉细胞中_______（填“DNA”或“mRNA”）含量得出。科学家发现突变体S表现出对白叶枯病很高的抗性，而白叶枯病是影响水稻产量的主要病害之一。根据实验三，提出一种预防水稻感染白叶枯病的方法为_____________________。

【简答题】

CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。

(1)研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA   键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过   次DNA复制可以完成修复。

(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是   。

(3)为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。

①PCR的一般过程为   ，在变性之前通常有预变性，其目的是   。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及   来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有   （至少答两点）。

②写出His的基因编码链的碱基序列5′   3′。

③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物   （填“A”或“B”）的5′端增加限制酶   的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′   3′。