【第 12517 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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镰状细胞贫血是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病，是由位于人类6号染色体上的血红蛋白基因发生隐性突变导致的，纯合子患者多数在幼年时期因红细胞严重溶血而亡。某夫妻双方都为该致病基因的携带者，为了生下健康孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为这对夫妇及腹中孩子核酸分子杂交诊断的结果示意图。
请回答下列问题：

（1）由图中可知，正常基因B有三个酶切位点，由于发生了_____________________导致突变基因b 上只有两个酶切位点。凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱。与图中正常基因模板链杂交的碱基对应序列为__________________。
（2）根据凝胶电泳带谱分析，腹中胎儿的基因型为___________。
（3）若通过基因治疗将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞将有望彻底治愈镰状细胞贫血。某科研团队设想运用重叠延伸PCR 技术来实现对致病基因的定点诱变，原理如右图所示：

 【第 12462 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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动物器官移植到人体内（异种移植）或是解决全球器官紧缺的办法之一。研究团队对猪肾内皮细胞进行基因编辑、改造后，得到了3种工程细胞和可提供异种移植肾源的供体猪。具体流程及部分测量数据如图示。
 
(1)研究证实供体猪的3个聚糖抗原基因（3KO）会引致人类、猴等受体的组织不相容。若以未经改造的猪肾作为异体肾源进行器官移植，受体动物的______________________ 细胞和抗体都有可能对供体器官产生特异性攻击效应，导致出现______________________现象。利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除肾内皮细胞的3KO,该技术需人工设计一种“向导”RNA，其部分序列与3KO遵循__________原则结合，并引导Cas9蛋白断裂DNA双链，从而敲除3KO。
(2)研究表明7个人类基因（7TG）可增加不同物种之间的兼容性。获取7TG的方法有______________________（答出一种即可）。
(3)为验证敲除3KO、插入7TG对异体细胞的保护作用，研究者将三组细胞与受体猴血清共孵育，置于CO₂培养箱中培养，CO₂的主要作用是___________。测量裂解细胞数如图示。据此得出结论:          
 
(4)供体猪器官常携带多种病毒,其中部分病毒潜在人畜传播风险。例如已有实验证明PERV（猪内源性逆转录病毒）可以整合到体外培养的人类细胞基因组中。试分析若给人进行异种移植，PERV的基因可能通过供体猪器官整合到人类基因组的途径_________________________________ 。因此，为确保安全，对已构建好的3KO.7TG.细胞需要进行灭活PERV处理，且在临床试行前须在动物模型中测试。
(5)从3KO.7TG.RI.细胞通过④过程构建供体猪所利用的现代生物学技术有________________（至少答出一种）

 【第 12461 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。

回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是___________。

(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________（答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。

 【第 12459 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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斑点叶突变体是水稻在正常生长条件下在叶片或叶鞘上自发形成斑点的一类突变体，研究斑点叶突变体对揭示水稻的抗病反应机理具有重要意义。对野生型水稻进行诱变处理，获得一个水稻斑点叶突变体S。
【实验一】将突变体S与野生型水稻杂交，F1植株均为野生表型。F₁自交产生的F₂植株中，野生表型与斑点叶表型的比例接近3：1。
【实验二】检测发现，突变体S出现斑点叶表型是水稻中E基因突变所致（记为ES）。再对野生型与突变体S进行PCR扩增测序，测得相关基因和转录剪切后的mRNA的部分序列如图所示。

【实验三】进一步检测野生型和突变体S中E基因的相对表达量，发现突变体S中的表达量相较野生型显著下降。
回答下列问题：
(1)实验一F₂植株出现野生表型与斑点叶表型比例为3：1的原因是_________。
(2)实验二中，与野生型E基因序列相比，突变体S的ES基因中碱基对发生的变化为_____________。
(3)转录过程中通过_______酶的作用合成mRNA。真核生物中转录合成的mRNA在特定位点被识别后，部分序列在此会被剪切掉，其余序列加工形成成熟的mRNA。据此推测，突变体S成熟mRNA序列中只多出“AUAG”4个碱基的原因是_____________________。
(4)E基因表达水平的变化可通过分析水稻叶肉细胞中_______（填“DNA”或“mRNA”）含量得出。科学家发现突变体S表现出对白叶枯病很高的抗性，而白叶枯病是影响水稻产量的主要病害之一。根据实验三，提出一种预防水稻感染白叶枯病的方法为_____________________。

 【第 12456 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。

 【第 12409 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。
 
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“反相关”)关系。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
 
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有
_______________________________________________________________________________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。
(4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 
c．病毒发生变异

 【第 12328 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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番木瓜很容易感染番木瓜环斑病毒（英文缩写为PRSV），该病毒是生产番木瓜的限制因素。我国科研人员利用农杆菌转化法，将番木瓜环斑病毒株系Ys的复制酶基因转入番木瓜，成功培育出转基因番木瓜“华农一号”。其大致流程如图所示。回答下列问题：
 
（1） 过程①称为___________；选用Ti质粒作为载体，是因为__________________。为让Ys的复制酶基因定向插入Ti质粒上，需在Ys的复制酶基因两端分别添加限制酶__________________的酶切位点。
（2） 过程③将重组质粒转入农杆菌之前，需先用__________________ 处理农杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态；为筛选出含重组质粒的农杆菌，应将转化的农杆菌培养在含卡那霉素的培养基上。过程⑤运用的生物技术利用的生物学原理是___________________________。
（3） 若要从个体生物学水平鉴定培育的转基因番木瓜植株是否具有抗番木瓜环斑病毒的特性，应进行的操作是___________________________。
（4） 番木瓜是直接供人们食用的转基因水果，一直以来也是转基因安全性争议的焦点之一。对于转基因食品的安全性，公众主要担心的是___________________________。

 【第 12327 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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下图为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图中Amp^R为氨苄青霉素抗性基因，Tet^R为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物X-gal转化成蓝色物质，使大肠杆菌的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶后的括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。请回答：
  
（1） 利用PCR技术对一个目的基因扩增n次，需要___________对引物，耐高温的DNA聚合酶能从引物的______ 端开始连接脱氧核苷酸，从而获得大量目的基因D。
（2） 据图分析，质粒A、C不能作为目的基因D的载体，理由分别是______________________。
将目的基因D与质粒B进行重组，应该选用限制酶___________和DNA连接酶。
（3） 在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因D是否重组到质粒中，使用EcoRⅠ处理重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.6kb和3.1kb，或者___________kb和___________kb的片段，则可判断质粒B已与目的基因D重组成功。
（4） 利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中，筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞，方法是在含有______________________的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。

 【第 12201 题】 【题型】：简答题 【章节】：第3节 基因工程的应用  
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COR基因是植物的冷调节基因，其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害，具有提高抗寒性的作用。转录因子CBF(由CBF基因控制合成)能够特异性结合下游的靶基因启动子区，激活COR基因的表达。将不同植物的COR基因和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，转入植物体内能大幅提高植物的抗寒性。在构建基因表达载体时，需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不同的限制酶。当遇到平末端和黏性末端无法连接时，可利用Klenow酶特有的与DNA聚合酶作用相同的特性，将黏性末端补平后再与平末端连接。
(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段，根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B，在PCR过程中，经过四次循环消耗引物A和引物B共________________个，引物的作用是________________________________________________________________。
(2)现有若干种限制酶，它们的识别序列和切割位点如图所示。为将COR基因表达载体和CBF基因组合构建抗寒基因超量表达载体，应选用Hed Ⅰ切割COR基因表达载体、用________________切割CBF基因的某一侧后再连接。为实现CBF基因与COR基因表达载体的另一侧连接，共需用到________________种酶。
 
(3)在转入超量表达载体的转基因植物中，转录因子CBF特异性识别下游的靶基因启动子区后，与______酶结合形成复合体，从而激活COR基因的表达。检测COR基因及其表达过程，可以采用的方法有____________________________________________________________________(至少写出两种)。
(4)科学家在培育的转基因植物中，筛选到一棵AtNUP160植株(atnup160基因的突变体)，AtNUP160基因表达产物能通过干扰核孔复合体的形成，影响RNA的出核转运，进而影响植物的抗寒性。研究发现，AtNUP160植株中CBF基因表达水平降低，影响了COR基因的表达，导致抗寒性减弱。由此推断AtNUP160植株抗寒性减弱的机理是______________________________。

 【第 12200 题】 【题型】：简答题 【章节】：第3节 基因工程的应用  
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钙依赖蛋白激酶(CDPK)在植物的信号传导和提高植物抗性方面发挥着重要作用。科学家通过将CDPK基因导入拟南芥(双子叶植物)中，来获得具有抗性的新品种。如图为某种质粒表达载体和含CDPK基因的DNA片段示意图，图中标记了限制酶的切割位点。据此回答下列问题：
 
(1)通过基因工程，将CDPK基因导入拟南芥中，获得具有抗性的新品种的育种原理是____________________。为了使CDPK基因插入质粒中，应选取____________________(两种限制性内切核酸酶)分别切割质粒和含目的基因的DNA片段。
(2)利用PCR可获得大量的CDPK基因，PCR扩增的第一步：用微量移液器在微量离心管中加入缓冲液、4种脱氧核苷酸的等量混合液、水、还需要加入________________________。PCR的产物一般通过琼脂凝胶电泳来鉴定，在凝胶中的DNA分子的迁移速率与_______________有关。
(3)将CDPK基因导入拟南芥细胞通常采用的方法是_________________________________。
(4)检测CDPK基因是否成功表达的方法是______________________，若有杂交带出现，表明已产生了CDPK。