【简答题】下图为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图中Amp^R为氨苄青霉素抗性基因，Tet^R为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物X-gal转化成蓝色物质，使大肠杆菌的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶后的括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。请回答：
  
（1） 利用PCR技术对一个目的基因扩增n次，需要_______对引物，耐高温的DNA聚合酶能从引物的______ 端开始连接脱氧核苷酸，从而获得大量目的基因D。
（2） 据图分析，质粒A、C不能作为目的基因D的载体，理由分别是______________。
将目的基因D与质粒B进行重组，应该选用限制酶_______和DNA连接酶。
（3） 在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因D是否重组到质粒中，使用EcoRⅠ处理重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.6kb和3.1kb，或者_______kb和_______kb的片段，则可判断质粒B已与目的基因D重组成功。
（4） 利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中，筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞，方法是在含有______________的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。

【答案】：（1） 2ⁿ-1   3' 
（2） 质粒A缺少标记基因、质粒C复制原点会被限制酶切割    PvuⅠ
（3） 0.6kb    4.1kb
（4） 氨苄青霉素和X-gal  白色

【解析】：（1） 利用PCR 技术对一个目的基因扩增n 次，产生2ⁿ 个DNA，其中模板DNA 不需要引物，因此消耗2ⁿ －1 对引物。耐高温的DNA 聚合酶只能从引物的3' 端开始连接脱氧核苷酸。
（2） 由题图可知，质粒A 缺乏标记基因，质粒C 复制原点会被限制酶切割，故不能选择质粒A、C作为目的基因的载体。目的基因的两端都有PvuⅠ的切割位点，而EcoRⅠ会破坏目的基因，故要获取目的基因，应该选用限制酶PvuⅠ，再用DNA 连接酶将目的基因D 与质粒B 的黏性末端进行连接。
（3） 目的基因和载体用一种酶进行切割，重组质粒（含2个EcoRⅠ酶切位点）会出现正向连接和反向连接两种类型，质粒B 中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.1kb，重组质粒中2个EcoRⅠ酶切点之间的最短距离可能是0.1+0.5=0.6kb 或0.1+1.5=1.6kb，重组质粒长度为2.7+2=4.7kb，4.7-0.6=4.1kb，4.7-1.6=3.1kb，故EcoRⅠ酶切后，电泳图谱中出现长度为4.1kb 和0.6kb 片段或3.1kb 和1.6kb 的片段，说明重组质粒构建成功。
（4） 由题意可知，重组质粒中的LacZ 基因会被破坏，但能保留氨苄青霉素抗性基因，故若选择自身不含LacZ 基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，在含有氨苄青霉素和X-gal 的培养基上培养经过导入处理的大肠杆菌，则未成功导入重组质粒的大肠杆菌无法存活，而成功导入重组质粒的可以存活，能形成白色菌落的即为导入重组质粒的大肠杆菌，已成功导入空质粒的大肠杆菌形成蓝色菌落。