【第 12609 题】 【题型】：单选题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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RT-PCR是在体外从RNA合成互补DNA(cDNA)，再以cDNA为模板扩增DNA 的技术。下列有关说法错误的是
A.RT-PCR需要逆转录酶和Taq DNA 聚合酶的参与
B.对温度的控制是影响RT-PCR 能否成功的关键因素之一
C.若反应体系中混有RNA酶会导致RT-PCR 技术失败
D.RT-PCR 反应体系中需要添加缓冲液、核糖核苷酸、引物等

 【第 12597 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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纤维素酶主要由内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（EH）和β-葡萄糖苷酶（β-G）组成，纤维素酶广泛存在于自然界的细菌和真菌中，用于生产纤维素酶的生物一般是真菌，如木霉属真菌。如图表示从土壤中分离出高产纤维素酶的菌株并克隆表达降解纤维素的EG、EH和β-G的大致流程。回答下列问题：

（1）过程①所用的培养基需添加的唯一碳源是________，在该培养基上可以生长的微生物有________________，从这些微生物中挑选出木霉属真菌，常利用菌落的________________等特征。
（2）从分离出的木霉属真菌中筛选出高产纤维素酶的菌株时，需在培养基中添加刚果红，其主要作用是________。确定某菌株为高产纤维素酶菌株的依据是________________。
（3）过程④大量扩增目的基因，如EG基因、EH基因、β-G基因时，除了需要知道基因两端的部分碱基序列来设计引物之外，还应在引物的5′端添加相关限制酶的识别序列，原因有________（填字母）。
A．目的基因两端没有限制酶的识别序列
B．DNA聚合酶是从引物的3′端连接游离的脱氧核苷酸
C．3′端需要与模板链互补
（4）为了防止目的基因与质粒载体反向拼接，过程⑤常选用2种限制酶切割目的基因和质粒载体，对此两种酶的选择还有其他限制条件，如________________________________。
（5）过程⑥常用的受体细胞是大肠杆菌，其优点有________________（答出2点即可）。

 【第 12596 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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雌激素(E2)与雌激素受体(ERa)结合成复合物，引发靶细胞生命活动发生一系列变化。推测ERa作为转录因子调节pS2基因转录，进而调节靶细胞的生命活动。为证明该推测，进行了相关研究。分析并回答：
（1）尽管E2分布于全身的体液中，但人体肾上皮细胞对E2不敏感，分析其原因是该细胞中缺少____________。
（2）利用____________酶将pS2基因启动子与细菌荧光素酶基因连接，构建融合基因。
（3）为验证该推测，实验流程及结果如图：

①通过______技术将外源DNA导入肾上皮细胞。
②乙组肾上皮细胞导入的X基因是______基因。
③丙组导入____________，目的是排除其携带的基因对实验结果的干扰。
④推测丙组或丁组荧光素酶活性______。
⑤该实验结果是否支持“ERa作为转录因子调节pS2基因转录”？______。请陈述理由。_________________________________________

 【第 12595 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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某些膜内蛋白以紧密排列的方阵形式存在称为OAPs，OAPs的分布异常与某些神经性和神经肌肉性疾病相关。研究AQP4（一种水通道蛋白）与OAPs结构形成的关系，有助于揭示上述疾病的机制。请回答问题：

 【第 12594 题】 【题型】：简答题 【章节】：第2节 基因工程的基本操作程序  
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AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)是人体代谢的总开关，通过磷酸化下游多种蛋白质来调控细胞代谢。二甲双胍(Met)是目前应用最广泛的降糖药物，近年来，还陆续发现各种潜在功效。研究表明Met主要通过激活AMPK通路发挥作用。我国科学家针对Met的作用靶点进行了相关研究。
（1）AMP（腺苷一磷酸）可由ATP水解失去______个磷酸基团获得，当细胞缺少能量供应时，AMP/ATP比值升高，磷酸化激活AMPK(P-AMPK)，维持机体能量平衡。以往认为Met通过抑制位于__________________的有氧呼吸第三阶段而发挥作用。研究者将5 μmol/L的Met注入体外培养的小鼠干细胞，检测结果如图1。


实验数据显示___________________________，故Met并非通过提高AMP/ATP的比值激活AMPK。
（2）研究发现，加入Met后，胞内溶酶体膜质子泵活性降低。为探究Met的靶蛋白是否定位于溶酶体膜，研究者设计了“MET-P”探针寻找特定的靶蛋白，其机理如图2。


①利用“MET-P”探针钓取靶蛋白的原理为_________________________________________。
②经纯化、分析，确定PEN2为Met的靶蛋白。二者结合后，与溶酶体质子泵的ATP6AP1亚基结合形成复合体，导致质子泵__________________改变，最终使溶酶体上的AMPK被磷酸化激活。请利用基因工程的方法验证Met通过靶蛋白PEN2，最终激活AMPK。写出实验组的设计思路及预期结果：______________________________________。
（3）除溶酶体外，细胞质基质、线粒体内也有AMPK，分别在中等和重度能量不足时被激活。一些药物能全面激活细胞内AMPK，使AMPK磷酸化水平整体升高，造成不良反应。结合本文信息，请表述Met在治疗代谢性疾病中的优势：_____________________________________________。