【简答题】将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（作用为辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行下图所示操作。

注：F1～F3，R1～R3表示引物；T-DNA-LB表示T-DNA左边界；T-DNA-RB表示T-DNA右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
请分析并回答下列问题：
(1)本操作中获取目的基因的方法有______________。
(2)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用_______（选填“卡那霉素”或“潮霉素B”）初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(3)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是_______。
(4)穿梭质粒中通过使用两个p35s启动子，可以增加______________的结合位点，从而提高目的基因的转录效率，合成更多的mRNA，进而增加蛋白质的表达量。
(5)对T-DNA边界序列进行测序发现，在连接的T-DNA部分中，RB通常比LB更精确完整。RB连接序列更完整是因为与RB共价连接的VirD2蛋白可以保护它免受核酸外切酶消化。而较大的LB序列缺失是因为LB末端区域缺乏保护。为了直观地显示T-DNA的转移是否完整，可用绿色荧光蛋白基因（GFP）作为报告基因，构建在紧邻    _______（选填“左”或“右”）边界的位置。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1～1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白

 

 

【答案】：(1)PCR扩增和人工合成
(2)潮霉素B
(3)F3、R2
(4)RNA聚合酶
(5)左
(6)CD

【解析】：

【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。

【详解】（1）基因工程中获取目的基因的方法有人工合成和PCR技术扩增。

（2）结合基因表达载体的示意图可知，HygB^R位于T-DNA片段中，而Kan^R不在T-DNA片段中，HygB^R能表达，HygB^R表示潮霉素B抗性基因，能合成抗潮霉素B物质，因此用潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织。

（3）PCR扩增目的基因（由图可知，该目的基因是人工合成的1-1362基因序列与1363-1848基因序列拼接成的）时，引物应在目的基因的两端，所以为检测棉花植株是否导入目的基因，应选用的引物是F₃、R₂。

（4）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录，穿梭质粒中通过使用两个p35s启动子，可以增加RNA聚合酶的结合位点，从而提高目的基因的转录效率，使得更多的mRNA被合成，进而增加蛋白质的表达量。

（5）T-DNA-LB表示T-DNA左边界；T-DNA-RB表示T-DNA右边界，由于连接的T-DNA部分中，RB（右边界）通常比LB（左边界）更精确完整。T-DNA从农杆菌转移到植物细胞中时始于右边界止于左边界，即T-DNA首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制，然后进入植物细胞并整合到染色体上，且在T-DNA的转移过程中会出现不完整转移现象，即可能出现右边界被剪切，而左边界未被剪切的现象，因此，以绿色荧光蛋白基因（GFP)作报告基因研究T-DNA的转移，则GFP应构建在紧临左边界的位置。

（6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列来产生新的蛋白质，属于蛋白质工程。AB错误，CD正确。

故选CD。