【简答题】

长叶烯是重质松节油的主要成分，具有木香和龙涎香气，溶于甲苯，不溶于水，是合成香料、合成树脂和高能燃料的重要原料。尽管资源分布广泛，但长叶烯的产量有限，工业化生产受到限制，微生物发酵则为合成长叶烯提供了绿色可持续的途径。现有研究以大肠杆菌内源的MEP途径为基础，以法尼基焦磷酸(FPP) 为直接前体物质，在异源长叶烯合酶(lgfs) 的催化作用下环化合成长叶烯。此过程的调控策略有：①引入经密码子优化的lgfs，②过表达大肠杆菌FPP合成过程中关键酶基因idi、ispA ，提高前体物FPP的供应量，③加强大肠杆菌内源MEP途径2个关键酶基因dxs、dxr 的表达。请回答下列问题：

（1）为构建如图甲所示的重组pET28a-lgfs表达载体，需先将经密码子优化的lgfs 基因通过PCR特异性扩增，用于扩增lgfs 基因的引物是指_______________________。为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________（填“3'端”或“5' 端”）。

注:ori:复制原点;KanR:卡那霉素抗性基因;erg20:酿酒酵母来源的FPP 合酶关键酶基因

（2）除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________（答出2个结构即可）。将得到的重组pET28a-lgfs 表达载体、重组pET28a-lgfs-ispA-idi表达载体、重组pET28a-lgfs-erg20-idi 表达载体、重组pET28a-lgfs-ispA-idi表达载体+重组pET28a-dxs-dxr 表达载体，分别转入经__________________处理的大肠杆菌，构建出重组菌株A、重组菌株B、重组菌株C、重组菌株D。

（3）将各重组菌株分别发酵后，检测不同发酵时长发酵样品中所含长叶烯的产量，结果如图乙所示。

已知生成1 mol FPP 需要2 mol异戊烯基焦磷酸(IPP)和1 mol二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP) ，而MEP途径所产生的IPP与DMAPP摩尔比为5:1，过表达基因idi 会使IPP和DMAPP的消耗和形成达到平衡转换，从而直接影响FPP 的合成。另外，为避免IPP与DMAPP的积累对细胞生长产生毒性，需要加强FPP 合酶的表达，在此，采用了2种不同来源FPP合酶，即大肠杆菌ispA和酿酒酵母来源的erg20 进行加强，根据图乙结果推测ispA表达效果要优于erg20 ，判断依据是___________________。在采用ispA 的基础上，通过____________，还可以使长叶烯产量得到显著提高。

（4）为验证代谢途径中各关键酶基因的转录水平能够影响长叶烯的产量，请写出关键实验步骤：①___________；②___________；③荧光定量PCR 。

 

 

【答案】：(1)能与lgfs基因母链两端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸        5'端(1分)
(2)启动子、终止子(答“限制酶切割位点”也可给分)      Ca²⁺(1分)(答CaCl₂也给分)
(3)48h内菌株B中长叶烯的产量均高于菌株C的产量         过表达 dxs、dxr 基因
(4)提取总RNA(1分)     逆转录(1分)