【简答题】稻米的直链淀粉是由蜡质基因（waxy）控制合成的淀粉合成酶（GBSS）催化形成，直链淀粉含量高的米饭质地和适口性不高。将 waxy反义基因片段导入水稻细胞抑制内源基因表达，可降低直链淀粉含量。为防止同时导入的标记基因影响，科研人员构建了2种载体，通过共转化以期获得含有目的基因、不含标记基因和报告基因（gus）的转基因水稻，相关流程如下图。请回答下列问题。

(1)waxy反义基因片段导入水稻细胞后可抑制内源基因表达，原因是____。为构建反义基因与gus的融合基因，在利用PCR技术获取反义基因与 gus过程中，需要在设计的两对引物____端分别添加限制酶____、____的识别序列。
(2)过程③中将农杆菌1、2按照1：9比例充分混匀感染水稻愈伤组织，3天后转入含有___的选择培养基筛选抗性愈伤组织。抗性愈伤组织转入再生培养基经____形成胚状体，继而发育成 T₀代植株。
(3)提取T₀代植株的基因组 DNA，根据反义基因和 gus基因部分序列设计引物进行PCR1检测， 同时根据反义基因和终止子的部分序列设计引物进行 PCR2检测，结果如下图，其中M为标准参照，1为阳性对照，2为阴性对照，3~8号为抗性植株 DNA的 PCR产物。其中2 是根据____的DNA 为模板进行 PCR 的结果，据图可以确定____号植株为共转化失败的水稻。

(4)过程⑤将共转化成功的 T₀代植株进行自交，收获种子，取半粒种子进行 GUS 检测（gus的表达产物能使白色X-Gluc 水解生成蓝色产物）。选择检测结果为____色的种子种植得到T₁代植株。最终还需检测____，才可判断是否改良成功。

 

 

【答案】：(1)反义基因转录形成的mRNA可与内源基因mRNA结合，抑制翻译    5`     SalI和BamHⅢ       BamHЩ和HindⅢ
(2)潮霉素    再分化
(3)非转基因水稻      5、6
(4)白    稻米中直链淀粉的含量

【解析】：

值得研究的问题是为何要做共转化，两次筛选是如何达成育种目的的？

【分析】基因工程技术的基本步骤:

(1)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
(2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
(3)将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因沧法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
(4)目的基因的检测与鉴定:分子水平上的检测、检测目的基因是否转录出了mRNA、检测目的基因是否翻译成蛋白质、个体水平上的鉴定。

【详解】

(1)由于反义基因转录形成的mRNA可与内源基因mRNA碱基互补配对，从而使核糖体不能与mRNA结合，因此抑制翻译过程，所以wvaxy反义基因片段导入水稻细胞后可抑制内源基因表达;为构建反义基因与sus的融合基因，从图中看出，在反义基因两端存在SaI和BamHⅢ限制酶切位点，而在gus基因两端存在BamHⅢ和HimndⅢ现在酶切位点，DNA聚合酶延伸时，将脱氧核苷酸加到引物的3"端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5端，所以利用PCR技术获取反义基因与gus过程中，需要在设计的两对引物5'分别添加Sa/I和BamHm、BamHm和Hind皿的酶切位点，
(2)从图中看出T-DNA的序列中含有潮霉素抗性基因，而四环素抗性基因没有在T-DNA序列，所以需要将愈伤组织转移至含有潮霉素的选择培养基中筛选抗性愈伤组织;愈伤组织转入再生培养基经再分化形成胚状体。
(3)1为阳性对照，即含有目的基因的片段，2为阴性对照，即是根据非转基因的DNA为模板扩增的结构。在左图是根据反义基因和 gus基因部分序列设计引物进行PCRI检测，右图是根据反义基因和终止子的部分序列设计引物进行PCR2检测，5号和6号在左图中存在序列，而在右图中没有终止子，所以是共转化失败的水稻。
(4)实验的目的是通过共转化以期获得含有目的基因、不含标记基因和报告基因(gus)的转基因水稻，而gus的表达产物能使白色X-Gluc水解生成蓝色产物，所以进行GUS检测时，如果是白色，则不含GUS，选择检测结构为白色的种子种植，由于直链淀粉含量高的米饭质地和适口性不高，所以最终还要检测稻米中直链淀粉的含量。