【简答题】

基因工程的关键步骤是基因表达载体的构建，人类γ基因启动子及其上游的调控序列中存在着BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。为了确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置，科研人员用PCR技术扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，相关信息如图所示。请回答下列问题：

(1)基因表达载体包括复制原点、目的基因、             （答出3点）。据图可知，扩增的γ基因上游不同长度的片段中，扩增出最长的片段需要选用的引物组合为             。

(2)由于荧光蛋白基因缺少启动子，为了使荧光蛋白基因正常表达，需要在其             （填“Nhe I”或“Mun I”）侧接入启动子；启动子的作用是                                       。

(3)构建基因表达载体的过程中，除了注意酶切后目的基因和载体露出相同的黏性末端，还需要注意连接方向以便表达。据图分析，为了使荧光蛋白基因正常表达，γ基因启动子及其上游的             （填“R”或“F₁”）调控序列应接在荧光蛋白基因的Mun I端，             （填“R”或“F₁”）调控序列应接在荧光蛋白基因的Xho I端。

(4)引物的合成是PCR成功的关键，PCR扩增时，要有                                       ，以便合成引物。制作引物过程中需要注意             之间不能有互补的序列，同一引物内部也不能有互补的序列。

 

 

【答案】：(1)     标记基因、启动子、终止子     F₁-R
(2)     Mun I     RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录
(3)     R     F₁
(4)     一段已知目的基因的核苷酸序列     两种引物

【解析】：【分析】基因表达载体中应含有启动子和终止子，才能确保目的基因能顺利启动转录和终止转录。PCR时一般需要两种引物，才能将目的片段扩增出来，设计的引物中，同一引物自身和两种引物之间都不能有互补序列。

【详解】

（1）基因表达载体需要在受体细胞中稳定存在和表达，因此其结构必需含有复制原点、目的基因、标记基因、启动子和终止子等组分。据图可知，扩增的γ基因上游不同长度的片段中，若要扩增出最长的片段，需要选用的引物组合为F1一R。

（2）由于荧光蛋白基因缺少启动子，且荧光蛋白基因的Nhe I侧有终止子，为了使荧光蛋白基因正常启动转录，完成蛋白质的合成，需要在荧光蛋白基因的Mun I侧接入启动子。启动子是位于DNA上的一段特殊序列，其作用是RNA聚合酶特异性识别和结合的部位，能驱动基因转录形成RNA。
（3）分析题图，启动子启动转录后，转录的方向是从F1→R，若方向相反，转录出的RNA序列会发生改变。因此将相关序列插入荧光蛋白基因Mun I侧并使其顺利表达，转录方向必须保持F1→R，所以连接方向是Mun I端连接R调控序列，Xho I端连接的是F调控序列。
（4）PCR扩增时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物，合成的引物能与相应的已知序列碱基互补配对。制作引物的时候需要注意同一引物自身和两种引物之间都不能有互补序列，防止自身配对，以免降低引物与目的片段结合的机会，影响PCR效率。