【简答题】抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。

(1)构建含除草剂抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过限制酶和________酶与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列____(填“能”或“不能”)出现在目的基因内部，可通过____技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。
(2)为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆技术(图2)，其中In­Fusion酶可以将任何具有相同15 bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。
①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In­Fusion反应。
如果引物2上额外添加的片段对应GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段____。完成重组反应后，将重组表达载体加入经过____处理的农杆菌中。
②为筛选成功转入重组DNA分子的菌落，可以选取引物____扩增目的基因并电泳检测。请在图4中画出阳性菌落的电泳结果。
(3)农杆菌转化愈伤组织时，用含____的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织(假阳性)也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，则排除假阳性的原理是：报告基因GUS在____细胞中表达，而在农杆菌中不表达，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，假阳性的农杆菌____(填“出现”或“不出现”)蓝色。

 

 

【答案】：(1)DNA连接　不能　PCR　(2)①a、d　Ca²⁺　②1和4
 
(3)除草剂　真核　不出现

【解析】：(1)在构建基因表达载体时，需用限制酶将载体切开，需要DNA连接酶将目的基因与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列不能出现在目的基因内部，要保持目的基因的完整性，否则目的基因会被破坏。若目的基因两侧缺少相应的限制酶识别序列，可通过PCR技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列。(2)①结合图3分析，引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么进行In­Fusion反应时，A基因的右侧序列、GUS基因的左侧序列会连接在一起。还需要将A基因、GUS基因连接到载体上，根据质粒两条核苷酸链的方向(5′→3′)判断，引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段a、d，才能确保A基因的左侧序列、GUS基因的右侧序列分别与质粒连接。经Ca2+处理成为感受态细胞的农杆菌细胞，吸收外源DNA的能力增强。②为筛选成功转入重组DNA分子的菌落，可以检测A基因与GUS基因，因而可以选取引物1、4扩增目的基因并电泳检测。阳性菌落含有融合基因，约为1 400 bp，电泳结果见答案。(3)农杆菌转化愈伤组织时，需要用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织，能在该培养基上正常生长的愈伤组织具有对除草剂的抗性；愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织(假阳性)也可能在选择培养基上生长。成功实现转化的愈伤组织中具有抗除草剂的基因和GUS基因，而报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此用无色物质K分别处理上述的愈伤组织，出现蓝色的是无农杆菌附着的转化愈伤组织，无蓝色的是假阳性的农杆菌，这里依据的原理是GUS基因在真核细胞中表达，而在农杆菌中不表达。