【简答题】将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（作用为辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行下图所示操作。
注：F1～F3，R1～R3表示引物；T-DNA-LB表示T-DNA左边界；T-DNA-RB表示T-DNA右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
请分析并回答下列问题：
(1)本操作中获取目的基因的方法有________________。
(2)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________（选填“卡那霉素”或“潮霉素B”）初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(3)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________。
(4)穿梭质粒中通过使用两个p35s启动子，可以增加________________的结合位点，从而提高目的基因的转录效率，合成更多的mRNA，进而增加蛋白质的表达量。
(5)对T-DNA边界序列进行测序发现，在连接的T-DNA部分中，RB通常比LB更精确完整。RB连接序列更完整是因为与RB共价连接的VirD2蛋白可以保护它免受核酸外切酶消化。而较大的LB序列缺失是因为LB末端区域缺乏保护。为了直观地显示T-DNA的转移是否完整，可用绿色荧光蛋白基因（GFP）作为报告基因，构建在紧邻    ________（选填“左”或“右”）边界的位置。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1～1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白

【简答题】

长叶烯是重质松节油的主要成分，具有木香和龙涎香气，溶于甲苯，不溶于水，是合成香料、合成树脂和高能燃料的重要原料。尽管资源分布广泛，但长叶烯的产量有限，工业化生产受到限制，微生物发酵则为合成长叶烯提供了绿色可持续的途径。现有研究以大肠杆菌内源的MEP途径为基础，以法尼基焦磷酸(FPP) 为直接前体物质，在异源长叶烯合酶(lgfs) 的催化作用下环化合成长叶烯。此过程的调控策略有：①引入经密码子优化的lgfs，②过表达大肠杆菌FPP合成过程中关键酶基因idi、ispA ，提高前体物FPP的供应量，③加强大肠杆菌内源MEP途径2个关键酶基因dxs、dxr 的表达。请回答下列问题：

（1）为构建如图甲所示的重组pET28a-lgfs表达载体，需先将经密码子优化的lgfs 基因通过PCR特异性扩增，用于扩增lgfs 基因的引物是指___________________________。为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_________（填“3'端”或“5' 端”）。

注:ori:复制原点;KanR:卡那霉素抗性基因;erg20:酿酒酵母来源的FPP 合酶关键酶基因

（2）除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_____________________（答出2个结构即可）。将得到的重组pET28a-lgfs 表达载体、重组pET28a-lgfs-ispA-idi表达载体、重组pET28a-lgfs-erg20-idi 表达载体、重组pET28a-lgfs-ispA-idi表达载体+重组pET28a-dxs-dxr 表达载体，分别转入经_____________________处理的大肠杆菌，构建出重组菌株A、重组菌株B、重组菌株C、重组菌株D。

（3）将各重组菌株分别发酵后，检测不同发酵时长发酵样品中所含长叶烯的产量，结果如图乙所示。

已知生成1 mol FPP 需要2 mol异戊烯基焦磷酸(IPP)和1 mol二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP) ，而MEP途径所产生的IPP与DMAPP摩尔比为5:1，过表达基因idi 会使IPP和DMAPP的消耗和形成达到平衡转换，从而直接影响FPP 的合成。另外，为避免IPP与DMAPP的积累对细胞生长产生毒性，需要加强FPP 合酶的表达，在此，采用了2种不同来源FPP合酶，即大肠杆菌ispA和酿酒酵母来源的erg20 进行加强，根据图乙结果推测ispA表达效果要优于erg20 ，判断依据是______________________。在采用ispA 的基础上，通过______________，还可以使长叶烯产量得到显著提高。

（4）为验证代谢途径中各关键酶基因的转录水平能够影响长叶烯的产量，请写出关键实验步骤：①_____________；②____________；③荧光定量PCR 。

【简答题】稻米的直链淀粉是由蜡质基因（waxy）控制合成的淀粉合成酶（GBSS）催化形成，直链淀粉含量高的米饭质地和适口性不高。将 waxy反义基因片段导入水稻细胞抑制内源基因表达，可降低直链淀粉含量。为防止同时导入的标记基因影响，科研人员构建了2种载体，通过共转化以期获得含有目的基因、不含标记基因和报告基因（gus）的转基因水稻，相关流程如下图。请回答下列问题。

(1)waxy反义基因片段导入水稻细胞后可抑制内源基因表达，原因是____。为构建反义基因与gus的融合基因，在利用PCR技术获取反义基因与 gus过程中，需要在设计的两对引物____端分别添加限制酶____、____的识别序列。
(2)过程③中将农杆菌1、2按照1：9比例充分混匀感染水稻愈伤组织，3天后转入含有___的选择培养基筛选抗性愈伤组织。抗性愈伤组织转入再生培养基经____形成胚状体，继而发育成 T₀代植株。
(3)提取T₀代植株的基因组 DNA，根据反义基因和 gus基因部分序列设计引物进行PCR1检测， 同时根据反义基因和终止子的部分序列设计引物进行 PCR2检测，结果如下图，其中M为标准参照，1为阳性对照，2为阴性对照，3~8号为抗性植株 DNA的 PCR产物。其中2 是根据____的DNA 为模板进行 PCR 的结果，据图可以确定____号植株为共转化失败的水稻。

(4)过程⑤将共转化成功的 T₀代植株进行自交，收获种子，取半粒种子进行 GUS 检测（gus的表达产物能使白色X-Gluc 水解生成蓝色产物）。选择检测结果为____色的种子种植得到T₁代植株。最终还需检测____，才可判断是否改良成功。

【简答题】土壤盐碱化问题已经成为全球性难题，培育耐盐碱农作物是解决人类粮食安全和农业发展的重要途径。

(1)为研究高粱盐碱响应通路中相关基因AT1的作用，研究人员构建过表达植株（AT1-OE）。以高粱cDNA为模板，利用_____方法获取目的基因。如图1，选取最佳限制酶_____处理目的基因和质粒，构建重组质粒并转入农杆菌。
(2)将转化成功的农杆菌与高粱愈伤组织共培养，为筛选出T-DNA成功转入的愈伤组织，培养基中需加入_____，原因是_____。获得所需愈伤组织后，经_____发育成完整植株。同时构建基因敲除植株（AT1-KO）。
(3)检测植株在高碱土壤中的幼苗长势和作物产量，结果发现：相比野生型植株，AT1-KO植株_____，AT1-OE植株表型相反，说明AT1在高粱碱胁迫的响应过程中起负调控作用。
(4)高碱条件下，植物细胞内H₂O₂含量升高，推测AT1可能与运输H₂O₂的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法进行研究，实验原理如图2，若靶蛋白A和待测蛋白B有相互作用，用磁珠偶联抗A抗体使A沉淀，则B也会被沉淀下来。利用抗GFP抗体与磁珠偶联，对实验组和对照组总蛋白进行免疫共沉淀，实验结果如图3。

①检测总蛋白的目的是_____。
②通过条带_____可以判断，AT1与PIP2有相互作用。若想进一步验证该相互作用，可用_____抗体与新磁珠偶联再次进行实验。
(5)细胞内过量的H₂O₂积累会导致氧化应激，从而导致植物细胞死亡，降低植物存活率。研究显示PIP2磷酸化能够促进H₂O₂外排。综合上述信息，解释敲除AT1基因能显著提高植株耐盐碱性的原因_____。

【单选题】

人类γ基因启动子及其上游的调控序列中存在着BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。为了确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置，科研人员用PCR技术扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，相关信息如图所示。下列有关叙述错误的是：

A.为将扩增后的产物定向插入载体,指导荧光蛋白基因表达，需用MunI和XhoI处理载体
B.从产物扩增到载体构建完成的整个过程需构建7种载体
C.将构建的载体导人去除BCLIIA基因的受体细胞,可能出现含F1与R扩增产物的受体细胞无荧光，而含F2－F7与R扩增产物的受体细胞有荧光
D.向培养液中添加适量的雌激素，可导致部分受体细胞不再有荧光